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慢病毒载体冻干制剂的制备与稳定性研究

沈鸿伟 李明昊 徐南 邵佳琪 王镜 俞磊

沈鸿伟, 李明昊, 徐南, 邵佳琪, 王镜, 俞磊. 慢病毒载体冻干制剂的制备与稳定性研究[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2021, (3): 114-127. doi: 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.03.012
引用本文: 沈鸿伟, 李明昊, 徐南, 邵佳琪, 王镜, 俞磊. 慢病毒载体冻干制剂的制备与稳定性研究[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2021, (3): 114-127. doi: 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.03.012
SHEN Hongwei, LI Minghao, XU Nan, SHAO Jiaqi, WANG Jing, YU Lei. Preparation and stability study of lyophilized lentiviral vector[J]. Journal of East China Normal University (Natural Sciences), 2021, (3): 114-127. doi: 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.03.012
Citation: SHEN Hongwei, LI Minghao, XU Nan, SHAO Jiaqi, WANG Jing, YU Lei. Preparation and stability study of lyophilized lentiviral vector[J]. Journal of East China Normal University (Natural Sciences), 2021, (3): 114-127. doi: 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.03.012

慢病毒载体冻干制剂的制备与稳定性研究

doi: 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.03.012
基金项目: 国家自然科学基金(81872812, 81470861)
详细信息
    通讯作者:

    俞 磊,男,教授,博士生导师,研究方向为药物递送系统及肿瘤免疫治疗. E-mail: ylyh188@163.com

  • 中图分类号: R944.2

Preparation and stability study of lyophilized lentiviral vector

  • 摘要: 制备了一种新型慢病毒载体冻干制剂. 通过冻干保护剂处方的筛选与优化, 从外观、赋形性、色泽度、溶解性方面评价冻干制剂的理化性质, 确定最优处方为海藻糖0.30 g/mL、L-组氨酸0.31 mg/mL、L-丙氨酸0.178 mg/mL、CaCl2 0.020 mg/mL、MgSO4 0.015 mg/mL. 所制备的慢病毒载体冻干制剂外观良好, 残余水分含量低, 结构保持完整, 再分散性较好; 慢病毒载体生物滴度可高达9.37 × 107 IU/mL, 滴度回收率为50.15%. 影响因素稳定性实验、高温加速实验和反复冻融稳定性实验等研究显示, 真空冷冻干燥技术可用于慢病毒载体固体制剂的制备, 并且能够有效改善慢病毒载体不同温度条件下的储存效果、反复冻融稳定性以及对高温等不良环境的耐受能力.
  • 图  1  慢病毒载体冻干前后滴度值与回收率

    注: Da表示对照组原液, 即加入HBSS溶解的病毒样品; Db表示实验组原液, 即加入冻干保护剂溶解的病毒样品; Dc表示对照组–80 ℃样品, 即加入HBSS –80 ℃保存的病毒样品; Dd表示对照组用于冻干样品, 即加入HBSS冻干之后的病毒样品; De表示实验组–80 ℃样品, 即加入冻干保护剂 –80 ℃保存的病毒样品; Df表示实验组冻干样品, 即加入冻干保护剂冻干之后的病毒样品; Dc/Da代表对照组–80 ℃样品滴度回收率; Dd/Da代表对照组冻干样品滴度回收率; De/Db代表实验组冻存样品滴度回收率; Df/Db代表实验组冻干样品滴度回收率.

    Fig.  1  Titer value and recovery rate of lentiviral vector before and after freeze-drying

    图  2  慢病毒载体冻干制剂与冻存液滴度回收率

    Fig.  2  Recovery of the lyophilized lentiviral vector and cryopreservation titer

    图  3  正交实验结果分析图

    Fig.  3  Analysis diagram of orthogonal experiment results

    图  4  不同温度条件下滴度对数值结果

    Fig.  4  Titer log results at different temperatures

    图  5  反复冻融对于慢病毒滴度的影响

    Fig.  5  Effects of repeated freezing-thawing cycles on the titer of lentiviral vectors

    表  1  不同冻干保护剂的效果

    Tab.  1  Effects of different lyophilized protectants

    分组冻干保护剂处方
    HBSS
    15% 海藻糖、0.010 mol/L L-组氨酸、0.010 mol/L L-丙氨酸、0.10 g/L CaCl2、0.076 g/L MgSO4
    3.0% 海藻糖、3.0% 甘露醇、2.0% 右旋糖酐、1.5% 肌醇
    0.30% 人血白蛋白、2.0% 海藻糖、1.0% 甘露醇、2.0% 右旋糖酐、2.0% 蔗糖
    1.0% 甘油、20 mg/mL 蔗糖、25 mg/mL 甘露醇、1.0 mg/mL L-精氨酸、
    2.0 mg/mL 甘氨酸、2.0% PEG6000、1.5% 明胶
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    表  2  正交实验因素水平

    Tab.  2  Factor level of orthogonal experiment

    水平因素
    海藻糖/gL-丙氨酸/mgL-组氨酸/mgCaCl2/mgMgSO4/mg
    13.7508.90015.501.0000.7600
    215.00222.5387.525.0019.00
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    表  3  正交实验设计表

    Tab.  3  Orthogonal experimental design table

    实验号海藻糖/gL-丙氨酸/mgL-组氨酸/mgCaCl2/mgMgSO4/mg
    1 3.750 8.900 15.50 25.00 0.7600
    2 15.00 222.5 15.50 25.00 0.7600
    3 15.00 8.900 387.5 25.00 0.7600
    4 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880
    5 15.00 222.5 15.50 1.000 19.00
    6 3.750 222.5 15.50 25.00 19.00
    7 15.00 8.900 387.5 1.000 19.00
    8 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880
    9 3.750 8.900 387.5 25.00 19.00
    10 3.750 8.900 15.50 1.000 19.00
    11 3.750 222.5 387.5 1.000 19.00
    12 15.00 222.5 387.5 1.000 0.7600
    13 15.00 8.900 15.50 25.00 19.00
    14 15.00 8.900 15.50 1.000 0.7600
    15 15.00 222.5 387.5 25.00 19.00
    16 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880
    17 3.750 222.5 15.50 1.000 0.7600
    18 3.750 8.900 387.5 1.000 0.7600
    19 3.750 222.5 387.5 25.00 0.7600
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    表  4  慢病毒冻干制剂的理化性质评价

    Tab.  4  Evaluation of physical and chemical properties of the freeze-drying preparation technique

    冻干保护剂处方外观色泽复溶性
    预处方疏松, 粉末状白色良好, 30 s以内
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    表  5  不同冻干保护剂的效果

    Tab.  5  Effects of different lyophilized protectants

    冻干保护剂外观色泽复溶性
    Ⅰ组疏松, 呈蜂窝状橙黄良好, 30 s以内
    Ⅱ组疏松, 呈蜂窝状橙红良好, 30 s以内
    Ⅲ组较差, 起泡皱缩橙黄一般, 60 s以内
    Ⅳ组疏松, 呈蜂窝状橙黄良好, 30 s以内
    Ⅴ组疏松, 呈蜂窝状橙红良好, 30 s以内
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    表  6  正交实验结果表

    Tab.  6  Results of orthogonal experiment

    实验号海藻糖/gL-丙氨酸/mgL-组氨酸/mgCaCl2/mgMgSO4/mg生物滴度/(IU·mL–1)
    1 3.750 8.900 15.50 25.00 0.7600 2.12 × 107
    2 15.00 222.5 15.50 25.00 0.7600 2.32 × 107
    3 15.00 8.900 387.5 25.00 0.7600 2.01 × 107
    4 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880 3.17 × 107
    5 15.00 222.5 15.50 1.000 19.00 2.16 × 107
    6 3.750 222.5 15.50 25.00 19.00 2.29 × 107
    7 15.00 8.900 387.5 1.000 19.00 3.47 × 107
    8 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880 3.20 × 107
    9 3.750 8.900 387.5 25.00 19.00 4.54 × 107
    10 3.750 8.900 15.50 1.000 19.00 4.91 × 107
    11 3.750 222.5 387.5 1.000 19.00 4.22 × 107
    12 15.00 222.5 387.5 1.000 0.7600 3.89 × 107
    13 15.00 8.900 15.50 25.00 19.00 2.60 × 107
    14 15.00 8.900 15.50 1.000 0.7600 5.11 × 107
    15 15.00 222.5 387.5 25.00 19.00 3.96 × 107
    16 9.375 115.7 201.5 13.00 9.880 4.09 × 107
    17 3.750 222.5 15.50 1.000 0.7600 2.15 × 107
    18 3.750 8.900 387.5 1.000 0.7600 2.81 × 107
    19 3.750 222.5 387.5 25.00 0.7600 1.46 × 107
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    表  7  正交实验方差分析表

    Tab.  7  Analysis of variance of orthogonal experiment

    来源自由度Adj SSAdj MSFP
    模型 12 2.035 45 × 1015 1.696 21 × 1014 189.23 0
    线性 5 8.070 11 × 1014 1.614 02 × 1014 180.06 0
    海藻糖 1 6.563 38 × 1012 6.563 38 × 1012 7.320 0 0.042
    L-丙氨酸 1 1.645 09 × 1014 1.645 09 × 1014 183.53 0
    L-组氨酸 1 4.521 50 × 1013 4.521 50 × 1013 50.440 0.001
    CaCl2 1 3.439 20 × 1014 3.439 20 × 1014 383.67 0
    MgSO4 1 2.468 04 × 1014 2.468 04 × 1014 275.33 0
    2 因子交互作用 7 1.228 44 × 1015 1.754 92 × 1014 195.78 0
    海藻糖 × L-丙氨酸 1 7.207 12 × 1013 7.207 12 × 1013 80.400 0
    海藻糖 × MgSO4 1 4.591 37 × 1014 4.591 37 × 1014 512.21 0
    L-丙氨酸 × L-组氨酸 1 2.660 03 × 1014 2.660 03 × 1014 296.75 0
    L-丙氨酸 × CaCl2 1 4.330 05 × 1013 4.330 05 × 1013 48.310 0.001
    L-组氨酸 × CaCl2 1 4.194 36 × 1013 4.194 36 × 1013 46.790 0.001
    L-组氨酸 × MgSO4 1 2.089 88 × 1014 2.089 88 × 1014 233.15 0
    CaCl2 × MgSO4 1 1.369 98 × 1014 1.369 98 × 1014 152.83 0
    误差 5 4.481 91 × 1012 8.963 83 × 1011
    失拟 4 4.438 46 × 1012 1.109 61 × 1012 25.530 0.147
    纯误差 1 4.345 75 × 1010 4.345 75 × 1010
    合计 17 2.039 93 × 1015
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    表  8  回归拟合模型汇总表

    Tab.  8  Summary table of regression fitting model

    SR-sq/%R-sq(调整)/%R-sq(预测)/%
    94677599.7899.2594.96
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    表  9  多响应预测结果

    Tab.  9  Results of multiple response prediction

    变量 海藻糖/g L-丙氨酸/mg L-组氨酸/mg CaCl2/mg MgSO4/mg
    设置 15 8.9 15.5 1.0 0.76
    响应 拟合值 拟合值标准误差 95% 置信区间 95% 预测区间
    响应值 5.13287×107 8.49756×105 (4.91443×107, 5.35131×107) (4.80584×107, 5.45989×107)
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    表  10  高温加速实验(42 ℃)条件下慢病毒冻干制剂的保存效果

    Tab.  10  Preservation effects of freeze-drying preparations at 42 ℃

    时间/d外观色泽复溶性
    1 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    3 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    5 皱缩, 吸潮黏连 橙红 一般, 90 s以内
    7 皱缩, 吸潮黏连 橙红 一般, 90 s以内
    14 皱缩, 吸潮黏连 橙红 较差, 120 s以内
    21 皱缩, 吸潮黏连 橙红 较差, 120 s以内
    30 皱缩, 吸潮黏连 橙红 较差, 120 s以内
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    表  11  反复冻融对慢病毒冻干制剂保存效果的影响

    Tab.  11  Effects of repeated freeze-thaw cycles on the preservation of freeze-drying preparations

    反复冻融次数/次外观色泽复溶性
    1 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    2 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    3 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    4 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    5 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
    6 疏松, 呈蜂窝状 橙红 良好, 30 s以内
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  • 收稿日期:  2019-12-25
  • 刊出日期:  2021-05-01

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